近日，我院实验医学科/检验医学临床研究中心/生物治疗全国重点实验室耿佳研究员与华西第二医院陈路研究员团队合作在Nature Methods（IF：48）发表了题为“Real-time detection of 20 amino acids and discrimination of pathologically relevant peptides with functionalized nanopore”的研究论文。研究阐明纳米孔单分子检测新策略，实现了对全部20种天然氨基酸的直接区分，提出并验证了纳米孔外切酶实时多肽测序（Nanopore Exopeptidase Real-time Peptide Sequencing, NEPS）方法，为实现单分子蛋白质测序提供了可行途径，展示出生物传感器技术与人工智能算法结合的优异潜力。
图1.耿佳、陈路（左四、左五）与主要作者合影（左至右：陈山川、张丹、张明、王紫纯、唐超）。
人体内有超过百万种蛋白质，与水、脂肪和无机物等共同构成生物体。蛋白质是生命活动的主要承担者，例如胰岛素和胰高血糖素控制血糖高低；视紫质能够感应光子，对于正常视觉功能必不可少。许多疾病的发生与蛋白质的异常直接相关，例如缺乏凝血因子会引起血友病；异常淀粉样蛋白斑可损害神经元，是阿尔茨海默病的潜在诱因。破译蛋白质信息是探索生命现象、促进人类健康的关键一环。
蛋白质由20种氨基酸组成，其复杂程度远超仅由4种核苷酸组成的核糖核酸或者脱氧核糖核酸，因此对蛋白质进行测序的难度堪称破译“生命天书”。当前蛋白质测序的金标准是质谱测序法，但窄检测动态范围、短读长、复杂操作、昂贵价格等局限仍亟需突破。因此探索快速、实时、准确、便捷的蛋白质测序新技术是当前全球生物技术与医药领域共同关注的焦点与热门领域。
图2. 纳米孔实时检测多肽水解后的氨基酸
单分子技术可在单个分子灵敏度水平实时提供待检测物信息。近年来单分子蛋白质测序领域进展不断涌现，利用纳米孔技术已可直接区分20种氨基酸，但基于实时监测单个氨基酸分子的多肽水解测序仍待探索。该团队开发的NEPS技术首先通过在耻垢分枝杆菌孔蛋白A的孔道最窄处构建铜离子结合位点，使得氨基酸可与铜离子-纳米孔蛋白复合物结合，从而产生特异性电流信号。不同氨基酸的电流信号可被机器学习算法准确区分。该方法实现了全部20种天然氨基酸的高灵敏度、无修饰直接检测，且可拓展用于翻译后修饰氨基酸和非天然氨基酸的传感。进一步，结合多肽外切酶，实时监测多肽水解反应。水解产生的单氨基酸信号丰度大小与氨基酸在多肽序列中的位置信息有显著相关性，可用于推测多肽序列。同时，NEPS技术还被验证可识别和区分与肿瘤和阿兹海默症等疾病相关的10种多肽。
图3.第一作者张明在单分子蛋白质测序国际会议报告相关进展
NEPS技术为最终破译“生命天书”、更精准的疾病诊断和治疗、更快的药物开发提供了有力工具。研究文章的发表也体现了国际学术界对我国生物传感技术与蛋白组学工具的原始创新能力的认可。
实验医学科/生物治疗全国重点实验室耿佳研究员、华西第二医院西部妇幼医学研究院陈路研究员为共同通讯作者；四川大学研究生张明、博士后唐超、研究生王紫纯和陈山川为共同第一作者。该研究获得国家重点研发计划“智能传感器”重点专项、四川省科技厅、我院1·3·5计划等项目的资助支持。
